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猪流行性腹泻病毒乳汁中sIgA ELISA检测方法的初步建立

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猪流行性腹泻病毒乳汁中sIgA ELISA检测方法的初步建立
论文目录
 
摘要第1-5页
abstract第5-7页
英文缩略词表或符号表第7-12页
1 引言第12-18页
 1.1 PEDV概述第12-13页
  1.1.1 PEDV的形态结构第12页
  1.1.2 PEDV的理化性质第12页
  1.1.3 PEDV的培养特性第12-13页
 1.2 PEDV基因组基本结构及其编码的蛋白第13-14页
  1.2.1 PEDV的基因组基本结构第13页
  1.2.2 编码的蛋白第13-14页
 1.3 PED的流行病学、临床症状和致病机理第14-16页
  1.3.1 PEDV的发生与发展第14页
  1.3.2 PEDV的流行现状第14-15页
  1.3.3 PED的流行特点第15页
  1.3.4 主要致病机理第15页
  1.3.5 临床症状第15-16页
  1.3.6 PEDV的组织嗜性第16页
  1.3.7 组织病理变化第16页
 1.4 PEDV实验室诊断技术第16-17页
  1.4.1 免疫荧光法(IF)第16页
  1.4.2 中和试验第16-17页
  1.4.3 RT-PCR检测法第17页
  1.4.4 ELISA检测法第17页
  1.4.5 胶体金抗体检测技术(GICA)第17页
 1.5 研究目的第17-18页
2 材料与方法第18-32页
 2.1 材料第18-23页
  2.1.1 宿主细胞、抗体和病毒毒株第18页
  2.1.2 表达宿主菌种与表达载体第18页
  2.1.3 试验动物及阳性乳汁第18页
  2.1.4 病毒提取试剂盒和主要试剂第18-22页
   2.1.4.1 细胞培养液第18-19页
   2.1.4.2 大肠杆菌感受态细胞制备及转化用液第19-20页
   2.1.4.3 琼脂糖凝胶电泳溶液第20页
   2.1.4.4 诱导表达用液和培养基第20页
   2.1.4.5 SDS-PAGE电泳液第20-21页
   2.1.4.6 蛋白纯化相关试剂第21页
   2.1.4.7 Western-blotting用溶液第21页
   2.1.4.8 ELISA主要试剂的配制第21-22页
  2.1.5 主要仪器设备第22-23页
 2.2 方法第23-29页
  2.2.1 病毒的培养第23页
  2.2.2 PCR引物的设计第23页
  2.2.3 S蛋白截短基因的克隆与鉴定第23-26页
   2.2.3.1 病毒RNA的提取第23页
   2.2.3.2 反转录第23-24页
   2.2.3.3 PCR扩增目的基因第24页
   2.2.3.4 PCR产物的纯化与回收第24页
   2.2.3.5 目的基因与克隆载体的连接第24-25页
   2.2.3.6 大肠杆菌感受态细胞的制备与连接产物的转化第25页
   2.2.3.7 重组质粒DNA的抽提第25页
   2.2.3.8 重组质粒的酶切鉴定第25-26页
   2.2.3.9 序列测定与分析第26页
  2.2.4 目的基因表达载体的构建与鉴定第26-27页
   2.2.4.1 重组质粒pMD18-T-S和表达载体pGEX-4T-1的酶切第26页
   2.2.4.2 回收目的基因和线性表达载体第26页
   2.2.4.3 目的基因与载体DNA的连接与转化第26-27页
   2.2.4.4 pGEX-4T-S重组表达质粒的提取第27页
  2.2.5 S截短基因重组表达质粒的鉴定第27页
  2.2.6 重组蛋白的表达与纯化第27-28页
   2.2.6.1 重组菌的诱导表达第27-28页
   2.2.6.2 重组蛋白的纯化第28页
  2.2.7 纯化蛋白的SDS-PAGE鉴定及其蛋白浓度的测定第28页
  2.2.8 重组蛋白的Western-blotting分析第28-29页
 2.3 兔抗猪HRP-sIgA酶标二抗的制备第29-30页
  2.3.1 乳汁中免疫球蛋白的纯化第29页
  2.3.2 乳汁中sIgA的纯化第29页
  2.3.3 兔抗猪sIgA抗体的制备第29-30页
  2.3.4 兔抗猪sIgA抗体的HRP标记第30页
 2.4 间接ELISA试验条件的优化第30-32页
  2.4.1 抗原包被浓度和样品稀释倍数的确定第30页
  2.4.2 封闭液的确定第30页
  2.4.3 封闭时间的确定第30-31页
  2.4.4 一抗稀释液的筛选第31页
  2.4.5 一抗反应时间的确定第31页
  2.4.6 酶标抗体最适稀释倍数的确定第31页
  2.4.7 酶标抗体反应时间的确定第31页
  2.4.8 显色时间的确定第31页
  2.4.9 阴阳性临界值的确定第31-32页
 2.5 特异性试验第32页
 2.6 临床的应用第32页
 2.7 符合率试验第32页
3 结果第32-43页
 3.1 PEDV S截短基因的扩增结果第32页
 3.2 重组质粒pMD18-T-S的酶切鉴定结果第32-33页
 3.3 序列测定结果第33页
 3.4 原核表达质粒pGEX-4T-S的构建与鉴定结果第33-34页
 3.5 表达产物纯化结果第34页
 3.6 表达产物的Western-blotting分析结果第34-35页
 3.7 兔抗猪HRP-sIgA酶标二抗的制备结果第35-36页
  3.7.1 乳汁中sIgA纯化与鉴定结果第35-36页
  3.7.2 兔抗猪sIgA抗体制备结果第36页
 3.8 间接ELISA试验条件的优化结果第36-41页
  3.8.1 最佳抗原包被浓度和一抗稀释倍数的确定第36-37页
  3.8.2 封闭液的确定第37-38页
  3.8.3 封闭时间的确定第38页
  3.8.4 一抗稀释液的确定第38-39页
  3.8.5 一抗反应时间的确定第39页
  3.8.6 酶标抗体最佳稀释倍数的确定第39-40页
  3.8.7 酶标抗体反应时间的确定第40页
  3.8.8 底物显色时间的确定第40页
  3.8.9 间接ELISA阴、阳性临界值的确定第40-41页
 3.9 特异性试验结果第41-42页
 3.10 重复性试验结果第42页
 3.11 临床样品检测结果第42-43页
 3.12 符合率试验结果第43页
4 讨论第43-46页
5 总结第46-47页
致谢第47-48页
参考文献第48-55页

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